Дисфункция митохондрий наступает только тогда, когда количество митохондрий с мутацией преодолевает некоторую пороговую черту. Мы не можем исправить мутацию во всех митохондриях, - в клетке их слишком много. Большая честь методов генной терапии направлена на изменение соотношения мутантные/нормальные митохондрии.

Поэтому практически все методы генной терапии митохондрий направлены не на коррекцию мутантных генов, а на таргетную (направленную) деградацию ДНК в митохондриях с мутацией (Gene cleaving tools), что изменит соотношение митохондрий в сторону НЕмутантных. Данное направление носит название антигеномное и антирепликативное (при помощи данного способа мы разрушаем ДНК и устраняем нежелательные для нас митохондрии).

В данном направлении различают несколько методических подходов, которые мы коротко тут опишем с указанием их основных преимуществ и недостатков:

Использование ДНК-нуклеаз

Данный метод предполагает использование генноинженерных конструктов, которые кодируют сайт-специфичные ДНК нуклеазы (ферменты, которые расщепляют нуклеиновые кислоты строго в определенной точке - сайте), нацеленные на митохондрии. Их можно использовать для прицельного удаления последовательности мтДНК с мутацией, что изменяет соотношение гетероплазмии (мутантные митохондрии/здоровые митохондрии) в сторону здоровых. То есть в ядреный геном при помощи вектора (аденовирусного или другого) вносится ген, который кодирует специфический фермент. Если в митохондриальном геноме возникает мутация и появляется специфическая последовательность кода, то фермент разрезает такую митохондриальную ДНК и такая митохондрия с большой вероятностью элиминируется (или попросту убивается). Такие опыты проводились на культурах гепатоцитов мыши: использование генной терапии позволяло изменить уровень гетероплазмии за 6 часов. In vivo такой метод испытывали на мышиной модели при помощи внесения аденовирусного вектора. При этом экспрессия эндонуклеаз рестрикции (кодируемых внесенным генноинженерным вектором), направленных на митохондрии, эффективно изменяла уровень гетероплазмии в сторону желаемого варианта (здоровых митохондрий) и была относительно безопасным методом (Bayona-Bafaluy et al, 2005; Bacman et al, 2013)

dna.jpg

Рис. 1. Принцип генной терапии митохондрий – направленное повреждение мутантных копий мтДНК с последующей репликацией здоровых копий.

Недостатки метода: сложно найти ту мишень (последовательность), которая будет присутствовать только в мутантных митохондриях и не будет – в здоровых. Для более чем 200 мутаций мтДНК, ассоциированных с заболеваниями, только у двух обнаружен селективный таргет (та единственная и неповторимая последовательность) для возможного использования такого подхода. 

   1. Создание Zn-finger ДНК-связывающихся модулей (mitoZFN)

Инженерные «цинковые пальцы» zinc finger nucleases (ZFNs) - это химерные ферменты, содержащие две структурные единицы. Одна из которых катализирует расщепление ДНК, а вторая способна избирательно связываться с определенными нуклеотидными последовательностями в составе целевой молекулы. То есть одна единица связывается с «нужной» последовательностью, а вторая ее расщепляет.


Этот метод широко использовался и для редактирования ядерных геномов, но был вытеснен CRISPR Cas технологией. А вот для митохондриального геномного редактирования он по-прежнему широко применим. 

zn finger.png

Рис.2. Генная терапия митохондрий при помощи «цинковых пальцев» zinc finger nucleases (ZFNs), разрушающих мутантные копии митохондриальной ДНК, изменяя уровень гетероплазмии. 

Такие модули были созданы для практически всех 64 нуклеотидных комбинаций кодонов. Для удобства распознавания и последующего удаления к такому модулю можно добавить специфический флажок, облегчающий распознавание нужной последовательности, - метильную метку (в данном случае это DNMT3 метилтрансфераза). Тогда на таргетный для модуля нуклеотид прицепится метильная метка. Такой нуклеотид будет гораздо проще распознать для таргетного удаления. Поэтому такая комбинация (модуль mitoZFN, направленный на какую-то последовательность + генный конструкт со специфической нуклеазой, которая будет этот модуль узнавать и расщеплять) позволяет таргетно убирать специфические последовательности мтДНК.

Такой модуль испытывался на клеточных линиях с мутацией Т8993G (данная мутация ассоциирована с синдром Лея, нейропатией, атаксией и т.д) и в результате происходило изменение соотношения в сторону мтДНК «дикого типа» (без мутации). Что интересно, экспрессия нескольких комбинаций специфичных CD-specific mtZFNs использовалась также для элиминации «частой делеции» 4977-bp в культуре клеток. Данная делеция ассоциирована с офтальмоплегией и накапливается у всех людей в различных тканях в процессе старения. Особенно высоким уровнем делеции у человека характеризуются ткани мозга. Данная делеция потенциально является важным маркеров возрастной митохондриальной дисфункции.

Согласно полученным результатам, авторам удалось снизить уровень патологичного mtDNA гаплотипа ниже порогового уровня. Последующая репопуляция wild-type mtDNA приводила к существенному восстановлению OXPHOS функции в обработанных клетках (Gammage, 2014)

Недостатки метода: тяжело доставить большое количество модулей внутрь митохондрии, существуют не для всех кодонов.


   2. mitoTALENs (transcription activator-like effector nucleases)

Более перспективным средством избирательного воздействия на ДНК могут быть  конструкции на основе химерных нуклеаз, названные TALENs (от Transcription Activator-like Effector Nucleases) (Patananan, 2016). Роль ДНК-распознающих структур в них играют белковые домены, каждый из которых «узнает» только один нуклеотид. Природным прототипом таких доменов явились белки (TAL-effectors) некоторых бактерий, паразитирующих в клетках сельскохозяйственных растений.

При этом подходе нуклеазы могут определять отдельные нуклеотиды, обеспечивая связывание и расщепление практически любой последовательности, если только она начинается с тимидина. Этот подход успешно применялся для изменения уровня гетероплазмии в ооцитах мыши и на культуре клеток. На культуре клеток были разработаны mitoTALENs, нацеленные на два относительно частых патогенных варианта точечных мутаций: m.8344A>G tRNALys (ассоциирована с миоклональной эпилепсией) и m.13513G>A ND5 (MELAS/Leigh синдром) (Hashimoto, 2015)

Такой подход также использовался  на мышиной модели гетероплазмичной митохондриальной мутации. В этом исследовани AAV9-mitoTALEN вводили внутримышечно, внутривенно и интраперионального. При этом в мышцах и сердце уровень мутантной мтДНК существенно снижался и эффект был стабилен. Молекулярный дефект, а именно снижение уровня RNAAla был успешно исправлен таким лечением (Bacman, 2018)

Недостатки метода: тяжело доставить большое количество модулей внутрь митохондрии, вектор может быть слишком большой.

    3. CRISPR-Cas9

Данная методика, получившая широкое распространение для редактирования ядерного генома и , фактически, совершив революцию в этой области, все еще имеет ограничения для редактирования митохондриального генома. С ним есть сложности, так как проблематично доставить направляющую РНК внутрь митохондрии, более того, в митохондриях низкий уровень репарационных процессов NHEJ и HR. 

Недостаток всей этой группы методов, -  возможность снизить общее количество мтДНК ниже функционального порогового уровня, что усугубит проблему митохондриальной дисфункции и может привести к апоптозу клетки. 




Поддержка проекта

Если вы верите в силу митохондрий, поддержите проект MitoSpace финансово
или другими возможными способами

Поддержать проект