Основные маркеры данной группы включают определение и подходы:

  • Лактат, пируват и их соотношение

  • Креатинкиназа

  • Аминокислоты, органические кислоты

  • Карнитины

  • Метаболомика

  • Сывороточные цитокины и микроРНК

  • Использование молекул-репортеров (зонды)


Биохимические маркеры

Нарушение работы митохондрий сопровождается дефицитом системы окислительного фосфорилирования, что приводит к разнообразным метаболическим сдвигам, возникающим вторично. Биоматериалом для данных исследований может быть слюна, кровь, моча или спинномозговая жидкость.

Эти методы являются удобными, так как биоматериал для тестирования может быть собран неинвазивно (слюна, моча), либо минимально инвазивно (кровь).

Стандартные маркеры

Определение лактата, пирувата, креатинкиназы, аминокислот, органических кислот, карнитинов являются традиционными методиками диагностики митохондриальных заболеваний (Parikh, 2015), их тестирование является недорогим, однако, данные маркеры по отдельности обладают невысокой диагностической ценностью.

Лактат

Лактат накапливается, если гликолитическое расщепление глюкозы преобладает над окислением пирувата в митохондриях: при падении уровня кислорода в клетке либо при нарушении нормального функционирования митохондрий организм переключается на менее эффективное производство энергии (анаэробное) путем расщепления глюкозы с образованием АТФ. Лактат является основным побочным продуктом этого анаэробного процесса. Молочная кислота может накапливаться в случае, если она производится быстрее, чем печень успевает ее утилизировать. Когда ее содержание в крови значительно повышается, наступает гиперлактатацидемия, которая может далее развиться в лактацидоз, если молочная кислота будет продолжать накапливаться.

Диагностическая ценность определения существенной мерой зависит от условий забора крови. Значительно повышенный уровень лактата в плазме (> 3 ммоль / л) при правильном отобранной пробе свидетельствует о наличии митохондриальной дисфункции, которая может быть вызвана либо первичным митохондриальным заболеванием, либо, во-вторых, органическими ацидемиями, другими врожденными ошибками обмена веществ, токсинами, ишемия тканей и некоторые другие заболеваниями.

Прогностически ценным является также измерение лактата в спинно-мозговой жидкости (меньше артефактов при заборе), а вот в моче для диагностики митохондриального заболевания прогностическая ценность невелика.

У пациентов с истинным митохондриальным заболеванием чувствительность данного маркера оценивают в 34 – 62%, а специфичность 83 – 100% (Parikh, 2015). Лактат в крови в пределах нормы не исключает диагноза митохондриального заболевания (Debray, 2007).

Пируват

Промежуточный метаболит, играет важную роль в связи метаболизма аминокислот и углеводов в цикле трикарбоновых кислот, бета-окислении жирных кислот и комплексе дыхательной цепи митохондрий. Определение пирувата без определения содержания лактата имеет ограниченную клиническую значимость. Очень чувствителен к забору крови, необходимо использовать пробирки с NaF, нарушения при заборе приводят к повышению соотношения лактат:пируват.

Соотношение лактат:пируват (L:P ratio)

Является наиболее надежным маркером дифференциальной диагностики нарушений электронной транспортной цепи (ETC) от нарушений метаболизма пирувата. При этом, чем выше уровень лактата, тем более прогностически значимо оценивать соотношение (при уровне лактата < 2,5 ммоль/л L:P незначимо, при уровне 2,5-4,99 ценность составляет 70%, при уровне лактата >5 ммоль/л, прогоностически значимо в 96-100% случаев) (Debray, 2007). Чувствительность этого соотношения составляет 31%, а специфичность достигает 100 % (Parikh, 2015).

↑ L:P ratio (>20) – при многих нарушениях дыхательной цепи МХ.

↓ L:P ratio (<10)– при дефиците комплекса пируват-дегидрогеназы (у детей чаще всего задержка развития, гипоксия, судороги, атаксия).

Количественный анализ аминокислот

Из-за нарушения работы дыхательной цепи происходит повышения уровня некоторых аминокислот, чаще всего это аланин, глицин, пролин и треонин. Чувствительность и специфичность данного метода при дисфункции митохондрий не установлена (Parikh, 2015).

Органические кислоты в моче

Количественное определение уровня органических кислот мочи часто показывает нарушения у пациентов с митохондриальными заболеванием. Повышение уровня малата и фумарата, как было отмечено, лучше всего коррелируют с митохондриальным заболеванием в ретроспективном анализе образцов от 67 пациентов с митохондриальным заболеванием по сравнению с 21 пациентом с органическими ацидемиями; другие интермедиаты цикла лимонной кислоты показали низкую корреляцию (Barshop, 2004).

Карнитины

Карнитин служит митохондриальным челноком для свободных жирных кислот и ключевым акцептором потенциально токсичных сложных эфиров кофермента А. Это позволяет восстановить интрамитохондриальный кофермент А и удалить этерифицированные интермедиаты. Количественная оценка общего и свободного уровней карнитина в крови, наряду с профилированием ацилкарнитина, позволяет выявить первичные или вторичные дефекты окисления жирных кислот, а также некоторые первичные амино- и органические ацидемии. Хотя тестирование ацилкарнитина предлагается в различных обзорах, данных литературы недостаточно. Это тестирование обычно рекомендуется из-за связи вторичного нарушения окисления жирных кислот у пациентов с митохондриальным заболеванием (Parikh, 2015).

Метаболомика

Перечисленные ранее маркеры диагностики имеют значительный недостаток, они обладают довольно низкой специфичностью. Метаболомика – это изучение уникальных химических «отпечатков пальцев», т.е. низкомолекулярных метаболических профилей, сопровождающих то или иное изменение состояния организма.

Использование метаболомики как подхода было достаточно успешным в поиске биомаркеров при онкологических, сердечно-сосудистых, иммунологических заболеваниях.

Митохондриальная дисфункция – мультисистемное нарушение, поэтому использование метаболомики является достаточно перспективным подходом.

Материалом для анализа может выступать: спинномозговая жидкость, моча, слюна, кровь, биоптаты. Конечно, предпочтительным является наименее инвазивный субстрат. Пилотные исследования по анализу протеома и метаболома мочи у пациентов с манифестировавшим митохондриальным заболеванием, носителем заболевания и здоровым контролем вывялили ключевые различия по содержанию альбумина и ретинол-связывающего белка в моче (RBP) (Hall, 2015).

Методы анализа: ЯМР (NMR) спектрометрия или масс-спетрометрия (MS). ЯМР может использовать как жидкие, так и твердые образцы, однако, МС имеет более высокую чувствительность, что было показано при диагностике наследственной оптической нейропатии Лебера (Chao, 2016). 

Метаболомика как диагностический подход используется для оценки вклада митохондриальной дисфункции при диабетической нефропатии (Sharma, 2017), при болезни Альцгеймера (Kim, 2017), при биолярных нарушениях (Futamura, 2016), для дифференциальной диагностики при сердечной недостаточности (Hunter, 2016)

Метаболомика в совокупности с генотипированием – наиболее чувствительный биомаркер досимптоматического становления заболевания у его носителей (Steele, 2017)

Помимо диагностики митохондриальных заболеваний и патологий, связанных с дисфункцией митохондрий, интересным направлением является разработка диагностических показателей биоэнергетического здоровья для целей предсказательной медицины. Было показано, что тромбоциты могут быть биомаркерами митохондриальной дисфункции. Изменение работы митохондрий тромбоцитов наблюдаются при болезни Альцгеймера, Паркинскона, при серповидно-клеточной анемии. Был разработан интегрированный протокол оценки интактных тромбоцитов при помощи метаболомики и биоэнергетических параметров (поглощение кислорода/синтез АТФ, емкость окислительного фосфорилирования), измеренных при помощи mitochondrial stress test (MST) у здороровых доноров, после чего проводилась биоинформатическая обработка ассоциации данных (см. рисунок) (Chacko, 2019).


Циркулирующие цитокины и микро-РНК

В последние годы было установлено, что сывороточный fibroblast growth factor-21 (FGF-21) и сывороточный growth and differentiation factor-15 (GDF-15) – два многообещающих диагностических маркера митохондриальных заболеваний. Они более чувствительны и специфичны чем те, которые используются в клинической практике, но еще не включены в протоколы (Steele, 2017).

Было показано, что эти факторы являются более специфичными для митохондриальных нарушений, вызванных дефектами трансляции и поддержания мтДНК, в отличие от нарушений, вызванных нарушением дыхательных комплексов или факторов сборки.

Для диагностики заболевания специфичность данных маркеров невысока, так как оба они могут повышаться и при диабете, ожирении, заболеваниях печени и др, однако, так как данные состояния потенциально связаны с нарушением работы митохондрий, маркеры могут использоваться для возрастного снижения функции митохондрий. FGF-21 образуется главным образом в скелетных мышцах, поэтому его диагностическая ценность наиболее высока при саркопении и миопатиях. Специфичность маркера при миопатии составила 89.3 %, а чувствительность, - 67.3 % (Finsterer, 2018).

МикроРНК – некодирующие геномные регионы, длиной всего в плюс-минус 20 нуклеотидов, которые контролируют генную экспрессию. Сывороточные микроРНК все чаще используются в целях диагностики, в том числе при заболеваниях, потенциально ассоциированных с дисфункцией митохондрий: заболевания мышц, митоническая дистрофия, метаболические нарушения. Было показано, что в клетках, несущих мутацию  m.3243A>G, выявляется определенный паттерн микроРНК (9/9*) (Lehtonen, 2016).

Дисфункция митохондрий также приводит клетку в состояние сенесцентности, характеризующуюся при этом определенным секреторным фенотипом (Wiley, 2016), включающим IL-10, TNF-α и CCL27, но не имеющим IL-1 сигнального звена.

Использование малых молекул-репортеров (зонды)

Позволяют количественно измерить функцию митохондрий, специфичные для митохондрий метаболиты и образование активных форм кислорода in vivo. Сделанные на заказ зонды, вводимые внутривенно интактному организму, накапливаются в митохондриях и реагируют с интересующим субстратом. После реакции с субстратом, пробы изменяются, образуя «экзомаркер» (экзогенный маркер). Он затем может быть извлечен для проведения его количественного анализа, на основании которых можно сделать выводы о реагирующем субстрате. В настоящее время методика находится в доклиническом развитии (Logan et al., 2014).

На клеточной модели была измерена концентрация ROS при помощи SNAP-taq методики, основанной на применении малой молекулы-репортера SNAP-peroxy green (Finsterer, 2018)

Метод потенциально может оценить доставку лекарств в митохондрии и количественной оценки лекарственной активности (Hoogewijs et al., 2016); а также гипотетическое определение оптимальной дозы препарата для отдельных пациентов.

An external file that holds a picture, illustration, etc. Object name is nihms-185705-f0006.jpg

Рис. 2 Таргетная маркировка ЭПС и митохондрий STG2 (Srikun, 2010)


Поддержка проекта

Если вы верите в силу митохондрий, поддержите проект MitoSpace финансово
или другими возможными способами

Поддержать проект