Методики микроскопии и imaging-методики

К данной группе методов можно отнести следующие методики диагностики функционирования митохондрий и нарушения их работы:

  • Биопсия (с различными сопутствующими методами визуализации)

  • Структурная визуализация (УЗИ, КТ, МРТ)

  • Функциональная визуализация (МРС, ПЭТ, ДЯП)



Методики микроскопии и imaging-методики

Биопсия тканей

Методики биопсии являются инвазивными, времязатратными и дорогостоящими, но все еще являются одними из основных методов диагностики митохондриальных нарушений. Чаще всего проводят биопсию скелетных мышц или кожи. При подозрении на заболевание также возможна биопсия печени, миокарда.

Взятую биопсию можно анализировать гистохимически и иммунологически, оценить количество митохондрий в образце ткани, их интактность. При этом используются различные методики визуальной оценки. В настоящее время доступно большое количество красителей, в т.ч. флюоресцентных, а также антител для визуализации митохондрий. Самыми используемыми красителями являются MitoTracker Green и MitoTracker Red. Комбинации красителей позволяют оценить в клетках такие показатели работы митохондрий, как: мембранный потенциал, функционирование кальциевого потока, рН и даже процессы митофагии. Большое количество красителей и их комбинаций предлагают и thermofisher и sigmaaldrich и idea-bio др.

При биопсии стандартным способом окрашивания для диагностики митохондриальной миопатии  является окрашивание трихрома Гомори (окрашивание коллагеновых волокон) (рис.1)


Рис. 1 Мышечная биопсия показала митохондриальные аномалии: A: Модифицированное окрашивание трихрома Гомори, показывающее рваные красные волокна. B: Двойное окрашивание COX-SDH, показывающее несколько COX-негативных волокон.

Кроме этого, возможно выделить митохондрии и провести оценку их функционирования (изучить ультраструктуру, биохимический анализ дыхательной цепи).

Структурная визуализация

Возможно проводить в тех органах и тканях, которые обычно затрагивает дисфункция митохондрий, - мышцы, мозг, сердце. Данная группа методов включает ультразвуковую диагностику, компьютерную томографию, магнитно-резонансную томографию. Методики УЗИ, КТ, стандартной МРТ чаще всего используются при наследственных миопатиях и неприменимы при незначительной дисфункции. 

Функциональная визуализация

Магнитно-резонансная спектроскопия (МРС, MRS)

Позволяет проводить количественную оценку метаболитов тканей в устойчивом состоянии. Для оценки работы митохондрий чаще всего используются спектры 31P и 1H.

1H позволяет захватывать тканеспецифичные метаболиты, такие как лактат, холин, N-ацетиласпартат и другие (рис.2), 


Рис.21H-MRS химический сдвиг нормальной взрослой левой височной доли в 3T. Ось Y представляет обнаруженную концентрацию или интенсивность метаболита в молях на литр ткани или в миллимолярных (мМ). Ось X представляет собой частоту химического сдвига в частях на миллион (ppm), на которой указаны метаболиты. Примечание: холин +, общий холин; Cr + PCr, креатин + фосфокреатин; Gln, глютамин; Глу, глутамат; GSH, глутатион; ММ, макромолекулы; NAA, N-ацетил-аспартил; НААГ, НАА-глутаминовая кислота ( Ford, 2016).

В то же время  31P захватывает относительные пропорции метаболитов фосфора и, следовательно, окислительную емкость.

31P – МРС скелетных мышц может производиться и в покое, однако, оценка оксидативной емкости основывается на времени восстановления фосфокреатинина, которое является непосредственным отображением синтеза АТФ в митохондриях (истощение фосфокреатинина при выполнении упражнений). 31P – МРС  в скелетных мышцах позволяет идентифицировать ключевые различия в биоэнергетике тканей при различных нейромышечных нарушениях.


Рис. 2. Использование спектра 31P-MR для неинвазивной оценки метаболизма скелетных мышц и печени (Valkovič, 2017)

1H-МРС мозга позволила выявить различия между здоровым контролем, людей с манифестировавшей мутацией m.3243A>G, бессимптомных носителей этого заболевания, у которых оно позже проявилось, и тех, у кого не произошла манифестация (Hall, 2015).

Позитронно-эмиссионная томография (PET, ПЭТ)

В отличие от MRS, которая обеспечивает измерение метаболитов в стабильном состоянии, ПЭТ измеряет метаболический поток, что позволяет изучать метаболические и гемодинамические свойства тканей.

Для изучения дисфункции митохондрий используются радиоизотопно-помеченные метаболиты 15O, 2-деокси-2 18F-флюор-d-глюкоза (FDG) и 11C-пируват, которые позволяют изучать тканеспецифичную энергетику. Наиболее изучены при помощи этого метода были пациенты с MELAS-синдромом. С применением методики изучались ткани сердца, мышц и мозга (Steele, 2017, Rodan, 2015).

К ограничениям относится использование радиоактивных изотопов.

Метод DNP (динамическая ядерная поляризация, ДЯП)

Использование в этой технологии процесса гиперполяризации позволяет достичь увеличения чувствительности МРТ в миллионы раз. То есть субстраты и их метаболиты можно исследовать in vivo даже при их низких тканевых концентрациях, например, АФК. Метод активно используются в диагностике онкологии (метаболиты опухолей), но использование гиперполяризованной глюкозы позволяет использовать этот метод для изучения гликолитических путей. 




Поддержка проекта

Если вы верите в силу митохондрий, поддержите проект MitoSpace финансово
или другими возможными способами

Поддержать проект